Synthese von Sialyl-Lewis X -Glycopeptiden und -Mimetika als Zelladhäsionsinhibitoren für E-Selektin

Die Selektine initiieren im Verlauf von Entzündungsprozessen einen ersten Zellkontakt zwischen Leukozyten und Endothelzellen und ermöglichen so die Auswanderung der Leukozyten aus den Blutgefäßen in das umliegende Gewebe, wo sie ihre immunologische Wirkung entfalten können. Viele Krankheiten gehen allerdings mit einer übermäßigen, durch Selektine vermittelten Zelladhäsion einher. Daher war es das Ziel dieser Arbeit, Selektininhibitoren zu synthetisieren, die pathologische Zelladhäsionsprozesse, wie man sie z.B. bei rheumatoider Arthritis, bei Erkrankungen der Herzkranzgefäße oder im Verlauf von Tumormetastasierungen findet, unterbinden können. Als Leitstruktur für solche Inhibitoren dient das auf den natürlichen Selektinliganden vorkommende Tetrasaccharid Sialyl-Lewis-X. Sialyl-Lewis-X stellt aber nur einen Teil der natürlichen Selektinliganden dar. Es bindet auch nur im millimolaren Bereich an die Selektine. Die komplexen natürlichen Selektinliganden wie z.B. ESL-1 (E-Selektin-Ligand-1), die an verschiedenen Glycosylierungs-stellen des Glycoproteins Sialyl-Lewis-X präsentieren, binden mit deutlich höherer Affinität an die Selektine. Für eine spezifische Rezeptorbindung sind daher außer dem Tetrasaccharid weitere Partialstrukturen verantwortlich, wobei gezeigt werden konnte, dass ein Anknüpfen von Sialyl-Lewis-X-Derivaten an die Partialsequenz 672-681 des ESL-1 eine Affinitätssteigerung hervorruft. Ein weiterer Nachteil des natürlichen Sialyl-Lewis-X-Tetrasaccharids im Hinblick auf seine pharmakologische Verwendung besteht darin, dass sowohl die fucosidische Bindung als auch die glycosidische Verknüpfung zur Neuraminsäure durch Enzyme leicht gespalten werden, wodurch Sialyl-Lewis-X als potenzielles Anti-Adäsionsmolekül an Wert verliert. Um die Kohlenydratliganden vor einem solchen enzymatischen Abbau zu bewahren, wurden in dieser Arbeit neben der im Sialyl-Lewis-X vorliegenden L-Fucose die im Menschen nicht vorkommenden Kohlenhydrate D-Arabinose und L-Galactose sowie neben der Neuraminsäure die (S)-Cyclohexylmilchsäure zur Herstellung der sechs Glycopeptid-Selektinliganden 1-6 mit der Partialsequenz 672-681 des ESL-1 verknüpft. Die Tetrasaccharide und Tetrasaccharid-Mimetika können aus den geschützten Monosacchariden und der geschützten Cyclohexylmilch-säure in parallelen Synthesen im Gramm-Maßstab hergestellt werden. Die automatisierten Glycopeptid-Festphasensynthesen wurden an einem Peptidsynthesizer nach der Fmoc-Strategie unter Verwendung von mit Asparaginsäure vorbeladenen TentaGel®-Harzen durchgeführt. Die Strukturen aller sechs Glycopeptide 1-6 wurden sowohl durch hoch auflösende massenspektrometrische Analysen als auch durch ein- und zweidimensionale NMR-Experimente belegt. Als Ergebnis dieser Arbeit liegen sechs Sialyl-Lewis-X-Glycopeptide und -Mimetika mit der Partialsequenz 672-681 des ESL-1 vor. Diese werden in Kürze auf ihre Wirksamkeit als Zelladhäsions-inhibitoren für E-Selektin getestet. Daraus sollen sich Erkenntnisse über Struktur-Wirkungs-Beziehungen gewinnen lassen, insbesondere was das kooperative Zusammenwirken von Saccharid- und Peptidteilstrukturen in der Erkennung der Liganden durch das E-Selektin anbetrifft.

Synthetische Glycopeptide mit Sulfatyl-Lewis X-Struktur als potenzielle Inhibitoren der Zelladhäsion

Zelladhäsionsprozesse sind von großer Bedeutung für zahlreiche biologische Prozesse, wie etwa die Immunantwort, die Wundheilung und die Embryogenese. Außerdem spielen sie eine entscheidende Rolle im Verlauf inflammatorischer Prozesse. An der Zelladhäsion sind verschiedene Klassen von Adhäsionsmolekülen beteiligt. Die erste leichte „rollende“ Adhäsion von Leukozyten am Ort einer Entzündung wird durch die Selektine vermittelt. Diese binden über die Kohlenhydrat-Strukturen Sialyl-Lewisx und Sialyl-Lewisa über eine calciumabhängige Kohlenhydrat-Protein-Bindung an ihre spezifischen Liganden und vermitteln so den ersten Zellkontakt, bevor andere Adhäsionsmoleküle (Cadherine, Integrine) die feste Adhäsion und den Durchtritt durch das Endothel bewirken. Bei einer pathogenen Überexpression der Selektine kommt es jedoch zu zahlreichen chronischen Erkrankungen wie z. B. rheumatoider Arthritis, Erkrankungen der Herzkranzgefäße oder dem Reperfusions-syndrom. Außerdem wird eine Beteiligung der durch die Selektine vermittelten Zellkontakte bei der Metastasierung von Karzinomzellen angenommen. Ein Ansatzpunkt für die Behandlung der oben genannten Erkrankungen ist die Gabe löslicher kompetitiver Inhibitoren für die Selektine. Ziel der Arbeit war die Modifikation des Sialyl-Lewisx-Leitmotivs zur Steigerung der metabolischen Stabilität und dessen Einbau in die Peptidsequenz aus der für die Bindung verantwortlichen Domäne des endogenen Selektin-Liganden PSGL-1. Dazu wurden mit einer modifizierten Lewisx-Struktur glycosylierte Aminosäurebausteine dargestellt (Abb.1). Die Verwendung von Arabinose und des Sulfatrestes anstelle von Fusose und Sialinsäure sollte außerdem zu einer gesteigerten metabolischen Stabilität des synthetischen Liganden beitragen. Die so erhaltenen Glycosylaminosäuren sollten nun in die Festphasenpeptidsynthese eingesetzt werden. Aufgrund der großen säurelabilität konnte hier nicht auf das Standartverfahren (Wang-Harz, Abspaltung mit TFA) zurückgegriffen werden. Deshalb kam ein neuartiges UV-labiles Ankersystem zum Einsatz. Dazu wurde ein Protokoll für die Synthese und Abspaltung von Peptiden an diesem neuen System entwickelt. Daran gelang die Synthese des nichtglycosylierten Peptidrückgrats sowie eines mit der dem sulfatierten Lewisx-Motiv versehenen Glycopeptids. Ein vierfach sulfatiertes Glycopeptid, welches durch den Einsatz von im Vorfeld chemisch sulfatierer Tyrosin-Bausteinen dargestellt werden sollte, konnte massenspektrometrisch nachgewiesen werden.

Die Synthese eines Sialyl-Lewis X-Mimetikums als Baustein zur Herstellung von Glycopeptid-Zelladhäsionsinhibitoren für Selektine

Zelladhäsionsphänomene spielen eine wichtige Rolle in vielen biologischen Vorgängen, wie z. B. in der Embryogenese, der Wundheilung, der Immunantwort und Entzündungsprozessen. So wird die inflammatorische Kaskade durch P- und E-Selektin vermittelte Adhäsion der im Blutstrom zirkulierenden Leukozyten an Endothelzellen eingeleitet. Übermäßige Zelladhäsion kann hingegen eine Vielzahl von Krankheiten bewirken. Nachgewiesen ist eine solche Beteiligung der Selektine u. a. bei rheumatoider Arthritis, Erkrankungen der Herzkranzgefäße und dem Reperfusionssyndrom. Ein Ansatz zur Therapie besteht in der Verabreichung löslicher Selektinliganden, die kompetitiv an die Selektine binden und deren Aktivität dadurch mindern. Die wichtigste Leitstruktur für pharmakologisch aktive Selektinliganden stellt hierbei das Tetrasaccharid-Epitop Sialyl-Lewisx (sLex) dar.rnrnIn dieser Arbeit wurde nach einer nicht enzymatischen Strategie ein auf der sLex Struktur basierender Baustein für die Festphasen-Peptidsynthese synthetisiert. Aus diesem sollen nach Schutzgruppen-Manipulationen durch Einsatz in automatisierten Festphasen-Peptidsynthesen, verschiedene Glycopeptide als Zelladhäsionsinhibitoren für Selektine gewonnen werden. Der rasche Abbau der sLex-Struktur im Organismus schränkt die pharmakologische Nutzung von sLex-Derivaten jedoch stark ein. Das synthetisierte Kohlenhydrat Epitop weist daher gegenüber der natürlichen sLex-Struktur mehrere Modifikationen auf, die zu einer erhöhten metabolischen Stabilität führen sollen, ohne die für eine effektive Bindung zum Rezeptor nötigen Wechselwirkungen zu beeinträchtigen. rnrnAus diesem Grund wurde der synthetisch anspruchsvolle Sialinsäure-Baustein durch die L-Cyclohexylmilchsäure substituiert. Die Anbindung des Kohlenhydrat-Epitops an das Peptid wird im Gegensatz zur natürlichen N-glycosidischen Verknüpfung hier über eine zusätzliche Glucosamin-Einheit O-glycosidisch an die Aminosäure L-Threonin bewirkt. Außerdem wird der labile Fucose-Rest durch die D-Arabinose ersetzt, die nicht im menschlichen Organismus vorkommt, jedoch die drei essentiellen pharmakophoren Hydroxylfunktionen in der gleichen dreidimensionalen Orientierung präsentiert wie die L-Fucose.

Synthese von tumor-assoziierten MUC1-Mucin-Glycopeptid-Vakzinen und deren immunologische Evaluierung

Eine alternative Methode zur Therapie von Tumorerkrankungen bestünde in einer Immuntherapie ausgelöst durch synthetische Antitumor-Vakzine. Ein vielversprechendes Zielmolekül für eine solche Aktivimmunisierung ist das Glycoprotein MUC1, das auf nahezu allen Epithelgeweben exprimiert und auf Tumorgeweben stark überexprimiert wird. Seine extrazelluläre Domäne enthält eine Vielzahl von Tandem-Repeat-Sequenzen der Art: HGVTSAPDTRPAPGSTAPPA mit fünf potentiellen O-Glycosylierungs-Positionen. Da die Form der Glycosylierung des MUC1 in Tumorzellen stark von der auf normalen Zellen abweicht, liegen auf Tumorzellen eine Reihe tumor-assoziierter Saccharidantigene und Peptidepitope vor.rnIn dieser Arbeit wurden tumor-assoziierte Glycopeptidantigene aus der MUC1-Tandem-Repeat-Region hergestellt. Die synthetisierten MUC1-Glycopeptide tragen in verschiedenen Positionen eine Glycosylierung mit den tumor-assoziierten Tn- und STn-Saccharid-Antigenen. Zur Gewinnung von Vakzinen wurden diese Glycopeptid-Antigene über einen Spacer mit immunstimulierenden Komponenten verknüpft. Als Immunstimulanzien wurden ein T-Zell-Epitop aus dem Ovalbumin (OVA323-339) sowie die Carrier-Proteine Rinderserumalbumin (BSA) und Tetanus-Toxoid (TTox) verwendet. rnDie synthetischen MUC1-Glycopeptide wurden durch Immunisierung von Mäusen einer immunologischen Evaluierung unterzogen. Insbesondere die synthetischen MUC1-Glycopeptid-TTox-Vakzine lösen sehr starke Immunantworten aus. Es konnte gezeigt werden, dass die induzierten Antikörper stark an Tumorzellen und auch an Mammakarzinom-Gewebe binden, was für die Entwicklung von Antitumor-Vakzinen als vielversprechend einzustufen ist.

Glycopeptidliganden von Zelladhäsionsrezeptoren mit sulfatierter Arabino-Lewis a-Struktur

Selektine sind eine Gruppe von Transmembranglycoproteinen, welche als Adhäsionsmoleküle innerhalb des vaskulären Systems Zelladhäsionsprozesse zwischen Leukozyten und Endothelzellen vermitteln. Das Sialyl-Lewisa Epitop und verwandte Kohlenhydratstrukturen wurden als Liganden der E- und P-Selektine identifiziert. Durch die chemische Synthese verwandter Strukturen verspricht man sich, die im Laufe inflammatorischer Prozesse exprimierten Rezeptoren gezielt blockieren zu können und dadurch pathologische Abläufe wie hämatogene Metastasierungen oder Abstoßungsreaktionen zu bekämpfen. Einige Bereiche der Aminosäuresequenz des E-Selektin-Ligand-1 (ESL-1) treten hochkonservativ auch in anderen Selektinliganden wie MG160 oder PSGL-1 auf und wurden deshalb für die N-Glycosylierung mit einem sulfatierten Oligosaccharid ausgewählt (11). -Val665-Glu-Cys-Arg-Asp-Ile-Val-Gly-Asn(Sulfo-Lea)-Leu-Tyr-Glu-Leu-Glu-Ser-Glu-Asp-Ile682- 11 Im ersten Teil der Arbeit wurde eine Strategie ausgearbeitet, das sulfatierte Trisaccharid 60 im Multigrammaßstab zu synthetisieren. Der endogene Ligand 2 wurde an drei Positionen modifiziert: Austausch der α-L-Fucose gegen die biologisch stabilere α-D-Arabinose, Einführung einer Sulfatgruppe anstelle der N-Acetylneuraminsäure sowie Übergang von O- zu N-glykosidischer Verknüpfung. Die hochregioselektive Einführung der Sulfatgruppe gelingt in sehr guten Ausbeuten durch Vorkomplexierung mit Dibutylzinnoxid und anschließende Umsetzung mit Schwefeltrioxid/Trimethylamin. Durch die Verwendung des anomeren Azids als permanente Schutzgruppe kann das Trisaccharid nach schonender Reduktion zum Amin an ein Asparaginsäurederivat angekuppelt und in einer linearen Synthese nach Fmoc-Strategie als N-Glycosylaminosäure in die Synthese eingebracht werden. Das in der Arbeitsgruppe Kunz entwickelte PTMSEL-Ankersystem 20a erlaubt sowohl die problemlose Synthese als auch die Abspaltung vom polymeren Träger unter sehr milden Bedingungen. Nach dem Entfernen der Benzylester und -ether durch Pd(0) – katalysierte Hydrierung können sulfatierte Glycopeptidsequenzen des Typs 11 über NMR-Spektroskopie (korrelierte Spektren) und Massenspektroskopie (ESI, MALDI) identifiziert werden.

Die Synthese von Glycopeptiden und Glycopeptid-Protein-Konjugaten mit einer Partialstruktur des tumorassoziierten Mucins MUC1 zur Entwicklung von Tumorvakzinen

„Synthese von Glycopeptiden und Glycopeptid-Protein-Konjugaten mit einer Partialstruktur des tumorassoziierten Mucins MUC1 zur Entwicklung von Tumorvakzinen“ Das Glycoprotein MUC1 ist in Tumorepithelzellen sonderlich stark überexprimiert und wegen der vorzeitig einsetzenden Sialylierung sind die Saccharid-Epitope der O-Glycanketten stark verkürzt (sog. tumorassoziierte Antigene). Dadurch werden auch bisher verborgene Peptidepitope des Glycoprotein-Rückgrates auf der Zelloberfläche der Epithelzellen zugänglich, die als fremd von den Zellen des Immunsystems erkannt werden können. Dies macht das MUC1-Zelloberfächenmolekül zu einem Zielmolekül in der Entwicklung von Tumorvakzinen. Diese beiden strukturellen Besonderheiten wurden in der Synthese von Glycohexadecapeptiden verbunden, indem die veränderten tumorassoziierten Saccharidstrukturen TN-, STN- und T-Antigen als Glycosylaminosäure-Festphasenbausteine synthetisiert wurden und in das Peptidepitop der Wiederholungseinheit des MUC1 durch Glycopeptid-Festphasensynthese eingebaut wurden. Wegen der inhärenten schwachen Immunogenität der kurzen Glycopeptide müssen die synthetisierten Glycopeptidstrukturen an ein Trägerprotein, welches das Immunsystem stimuliert, gebunden werden. Zur Anbindung der Glycopeptide ist ein selektives Kupplungsverfahren nötig, um definierte und strukturell einheitliche Glycopeptid-Protein-Konjugate zu erhalten. Es konnte eine neue Methode entwickelt werden, bei der die Konjugation durch eine radikalische Additionsreaktion von als Allylamide funktionalisierten Glycopeptiden an ein Thiol-modifiziertes Trägerprotein erfolgte. Dazu wurde anhand von synthetisierten, als Allylamide modifizierten Modellaminosäuren untersucht, ob diese Reaktion generell für eine Biokonjugation geeignet ist und etwaige Nebenreaktionen auftreten können. Mit dieser Methode konnten verschiedene MUC1-Glycopeptid-Trägerprotein-Konjugate hergestellt werden, deren immunologische Untersuchung noch bevorsteht. Das tumorassoziierte MUC1 nimmt in der immundominanten Region seiner Wiederholungseinheit eine knaufartige Struktur ein. Für die Entwicklung von selektiven Tumorvakzinen ist es von großer Bedeutung möglichst genau die Struktur der veränderten Zelloberflächenmoleküle nachzubilden. Durch die Synthese von cyclischen (Glyco)Peptiden wurde dieses Strukturelement fixiert. Dazu wurden olefinische Aminosäure Festphasenbausteine hergestellt, die zusammen mit den oben genannten Glycosylaminosäuren mittels einer Glycopeptid-Festphasensynthese in acyclische Glycopeptide eingebaut wurden. Diese wurden dann durch Ringschlussmetathese zyklisiert und im Anschluss reduziert und vollständig deblockiert. In einem dritten Projekt wurde der Syntheseweg zur Herstellung einer C-Glycosylaminosäure mit einer N-Acetylgalactosamin-Einheit entwickelt. Wichtige Schritte bei der von Glucosamin ausgehenden Synthese sind die Keck-Allylierung, eine Epimerisierung, die Herstellung eines Brom-Dehydroalanin-Derivates und eine B-Alkyl-Suzuki-Miyaura-Kreuzkupplung sowie Schutzgruppenoperationen. Der racemische Baustein konnte dann in der Peptid-Festphasensynthese eines komplexen MUC1-Tetanustoxin-Konjugates eingesetzt werden.

Synthese von Sialyl-Lewis-X-Mimetika durch stereoselektive ortho-C-Glycosylierung von Phenolen

Ziel der Arbeit war es, Sialyl-LewisX-Mimetika auf Basis ortho-C-glycosylierter Phenole als Inhibitoren für die Selektin-Ligand-Wechselwirkungen zu synthetisieren. Dazu wurde zunächst die Stereoselektivität der ortho-C-Mannosylierung untersucht. Dabei wurde gezeigt, dass bei der Umsetzung von Phenolen mit dem benzylgeschützten Mannosyl-trichloracetimidat in Gegenwart von TMSOTf selektiv das β-C-Mannosid erhalten wurde. Gleichzeitig konnte anhand der NMR-spektroskopischen Untersuchungen nachgewiesen werden, dass die in der Literatur beschriebenen α-C-Mannoside von Phenolen tatsächlich β-konfiguriert sind. Wenn Naphthole als Glycosylakzeptoren verwendet wurden, konnten durch Modifikation des Promotors auch die für die Synthese der Mimetika benötigten α-C-Mannoside erhalten werden, wobei ZnCl2 als Promotor die besten Ergebnisse lieferte. Allerdings zeigten die synthetisierten α-C-Mannoside und α-C-Galactoside eine Inversion des Pyranoseringes und lagen in der ungewöhnlichen 1C4-Konformation vor.rnAnschließend konnte auf diese Weise das durch Docking-Studien gefundene Mimetikum (2S)-3-Cyclohexyl-2-[7-hydroxy-8-(α-D-mannosyl)naphthalin-2-yloxy]propionsäure syntheti-siert werden. Es besaß jedoch in Zelladhäsionstests keine ausreichende Aktivität bei der Inhibierung der Selektin-Ligand-Wechselwirkung. Bei den ursprünglichen Dockingstudien war allerdings von der gewohnten 4C1-Konformation ausgegangen worden. Spätere NMR-Experimente und DFT-Berechnungen zeigten, dass das Mimetikum tatsächlich in der 1C4-Konformation vorlag und es deshalb nicht aktiv war. Die synthetisierten Stereo- und Regioisomere zeigten in Zelladhäsionstests ebenfalls keine Aktivität.rnVersuche, die α-1-C-Mannosylnaphthole zu den benötigten 1-C-2-O-Diglycosyl-naphthalinen umzusetzen waren nicht erfolgreich, da die phenolische OH-Gruppe sterisch zu sehr abgeschirmt war, um unter milden Reaktionsbedingungen glycosyliert zu werden, bzw. die α-1-C-Mannosylnaphthaline unter drastischeren Reaktionsbedingungen nicht stabil waren. Daher wurde 1-(2′,3′,4′,6′-Tetra-O-benzyl-β-D-galactopyranosyl)-2-naphthol mit 2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-α-D-mannopyranosyl-trichloracetimidat in Gegenwart von TMSOTf zum ersten synthetischen 1-C-2-O-Diglycosyl-phenol umgesetzt. Nach Abspaltung der Schutzgruppen sollte das erhaltene 1-Galactosyl-2-O-mannosyl-naphthalin enzymatisch zum Sialyl-LewisX-Mimetikum verlängert werden. Es wurde vom Enzym jedoch nicht als Substrat erkannt. Versuche zur chemischen Anbindung des Säurebausteins stehen noch aus.rn

Synthese von MUC1-Glycopeptid-Konjugaten mit fluorierten Analoga des Thomsen-Friedenreich-Antigens

Krebserkrankungen gehen oft mit der Überexpression von mucinartigen Glycoproteinen auf der Zelloberfläche einher. In vielen Krebserkrankungen wird aufgrund der fehlerhaften Expression verschiedener Glycosyltransferasen das transmembranständige Glycoprotein MUC1, mit verkürzten Glycanstrukturen, überexprimiert. Das Auftreten der verschiedenen tumor-assoziierten Antigene (TACA) korreliert meist mit dem Fortschreiten des Krebs und der Metastasierung. Daher stellen TACAs interessante Zielmoleküle für die Entwicklung einer aktiven Tumorimmuntherapie zur spezifischen Behandlung von Adenokarzinomen dar. In dieser Arbeit galt das Interesse dem epithelialen Mucin MUC1, auf Basis dessen ein synthetischer Zugang zu einheitlichen Antitumorvakzinen, welche aus mucinanalogen Glyco-peptid¬konjugaten des MUC1 und Carrierproteinen bestehen, hergestellt werden sollten.rnUm eine tumorspezifische Immunantwort zu erhalten, müssen die selbst schwach immunogenen MUC1-Antigene über einen nicht-immunogenen Spacer mit einem geeigneten Trägerprotein, wie Tetanus Toxoid oder Rinderserumalbumin (BSA), verbunden werden. rnDa ein Einsatz von Glycokonjugaten in Impfstoffen durch die metabolische Labilität der O-glycosidischen Bindungen eingeschränkt ist, wurden hierzu erstmals fluorierte Vetreter von MUC1-analogen Glycopeptiden verwendet, in denen das Kohlenhydrat-Epitop durch den strategischen Einbau von Fluor¬atomen gegenüber einem raschen Abbau durch Glycosidasen geschützt werden soll. Dazu wurden auf Basis des literaturbekannten Thomsen-Friedenreich-Antigens Synthesestrategien zur Herstellung eines 2’F- und eines 2’,6’-bisfluorierten-Analogons erarbeitet. rnSchlüsselschritte in der Synthese stellten neben der elektrophilen Fluorierung eines Galactalvorläufers auch die -selektive 3-Galactosylierung des TN-Antigen-Bausteins zum 2’F- und 2’,6’-bisfluorierten-Analogons des TF-Disaccharids dar. Durch entsprechende Schutzgruppentransformationen wurden die beiden Derivate in entsprechende Glycosyl¬amino-säure-Bausteine für die Festphasensynthese überführt.rnNeben den beiden Analoga des TF-Antigens wurde auch erstmals ein 2F-Analogon des 2,6-Sialyl-T-Antigens hergestellt. Dazu wurde der entsprechende 2’F-TF-Baustein mit Sialinsäure-xanthogenat nach bereits bekannten Syntheseprotokollen umgesetzt. Aufgrund von Substanzmangel konnte die Verbindung nicht zur Synthese eines MUC1-Glycopeptid-Analogons herangezogen werden.rnDer Einbau der hergestellten Glycosylaminosäure-Bausteine erfolgte in die aus 20 Amino-säuren bestehende vollständige Wiederholungseinheit aus der tandem repeat-Sequenz des MUC1, wobei die entsprechenden Glycanseitenketten stets in Position 6 eingeführt wurden. Um die erhaltenen Glycopeptide für immunologische Studien an Carrier-Proteine anbinden zu können und so ggf. zu funktionsfähigen Impfstoff-Konjugaten zu gelangen, wurden diese stets N-terminal mit einem nicht-immunogenen Triethylenglycol-Spacer verknüpft. Die anschließende Funktionalisierung mit Quadratsäurediethylester erlaubte die spätere chemoselektive Konjugation an Trägerproteine, wie Tetanus Toxoid oder BSA.rnIn ersten immunologischen Bindungsstudien wurden die synthetisierten BSA-Glycopeptid-Konjugate mit Serum-Antikörpern aus Vakzinierungsstudien von MUC1-Tetanus Toxoid-Konjugaten, die (i) eine natürliche TF-Antigenstruktur und (ii) ein entsprechendes TF-Antigenderivat mit Fluorsubstituenten an C-6 des Galactosamin-Bausteins und C-6’ des Galactoserests tragen, untersucht.rn

Die Synthese von Mucin-Glycopeptid-Vakzinkonjugaten und Adjuvanzien für eine potentielle Krebsimmuntherapie

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Synthese von unterschiedlichen tumorassoziierten Antigenen, die in Form von glycosylierten Aminosäurebausteinen durch Festphasensynthese in den tandem repeat des epithelialen Mucin MUC1 eingebaut wurden. Zur Erzeugung von selektiven Immunantworten wurden synthetische MUC1-Glycopeptide über einen nicht immunogenen Spacer mit einer Reihe von Immunstimulanzien umgesetzt. Es wurden hierbei zwei Ziele verfolgt. Zum einen sollten mit Hilfe von synthetischen MUC1-Glycopeptiden und Immunstimulanzien cytotoxische T-Zellen ausgebildet werden, die Tumorzellen mit überexprimiertem MUC1 am Wachstum hindern und sie in den programmierten Zelltod treiben. Zum anderen sollte mit Hilfe von TH2-Epitopen eine adaptive humorale B-Zell-vermittelte Immunantwort in Form von Antikörpern ausgelöst werden. Zur Ausbildung von cytotoxischen T-Zellen kamen Vakzinkonjugate zum Einsatz, die aus dem IL-1β(163 – 169), dem TLR2-Agonisten (Pam3Cys-Ser-Lys4) oder dem TLR4-Agonisten (spacergebundenes MPL A) bestehen und jeweils an MUC1-Glycopeptide konjugiert wurden. Darüber hinaus wurde eine neue moderne Syntheseroute für das MPL-A entwickelt, welches als Adjuvans in den verschiedenen Vakzinen, wie Cervarix®, Fendrix® und Stimuvax®, Verwendung findet und die Immunantwort der Vakzinkonstrukte nochmals verstärken sollte. Zur Induktion von Antikörpern kamen die OVA(323 – 339)-, die Tetanus-Toxoid- und die BSA-Konjugate zur Anwendung, an denen MUC1-Glycopeptide angeknüpft wurden.

Anwendung der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie zur Charakterisierung der Struktur von Zähnen und von oberflächenmodifiziertem Titan für Knochenimplantate

Zusammenfassung Mittels Fluoreszenzfarbstoffen können Strukturen sichtbar gemacht werden, die auf kon-ventionellem Weg nicht, oder nur schwer darzustellen sind. Besonders in Kombination mit der Konfokalen Laser Scanning Mikroskopie eröffnen sich neue Wege zum spezifischen Nachweis unterschiedlichster Komponenten biologischer Proben und gegebenenfalls deren dreidimensionale Widergabe.Die Visualisierung des Proteinanteils des Zahnhartgewebes kann mit Hilfe chemisch kopplungsfähiger Fluorochrome durchgeführt werden. Um zu zeigen, daß es sich bei dieser Markierung nicht um unspezifische Adsorption des Farbstoffes handelt, wurde zur Kontrolle die Proteinkomponente der Zahnproben durch enzymatischen Verdau beseitigt. Derartig behandelte Präparate wiesen eine sehr geringe Anfärbbarkeit auf.Weiterführend diente diese enzymatische Methode als Negativkontrolle zum Nachweis der Odontoblastenfortsätze im Dentin bzw. im Bereich der Schmelz-Dentin-Grenze. Hiermit konnte differenziert werden zwischen reinen Reflexionsbildern der Dentinkanäle und den Zellausläufern deren Membranen gezielt durch lipophile Fluoreszenzfarbstoffe markiert wurden.In einem weiteren Ansatz konnte gezeigt werden, daß reduzierte und daher nichtfluoreszente Fluoresceinabkömmlinge geeignet sind, die Penetration von Oxidationsmitteln (hier H2O2) in den Zahn nachzuweisen. Durch Oxidation dieser Verbindungen werden fluoreszierende Produkte generiert, die den Nachweis lieferten, daß die als Zahnbleichmittel eingesetzten Mittel rasch durch Schmelz und Dentin bis in die Pulpahöhle gelangen können.Die Abhängigkeit der Fluoreszenz bestimmter Fluorochrome von deren chemischer Um-gebung, im vorliegenden Fall dem pH-Wert, sollte eingesetzt werden, um den Säuregrad im Zahninneren fluoreszenzmikroskopisch darzustellen. Hierbei wurde versucht, ein ratio-metrisches Verfahren zu entwickeln, mit dem die pH-Bestimmung unter Verwendung eines pH-abhängigen und eines pH-unabhängigen Fluorochroms erfolgt. Diese Methode konnte nicht für diese spezielle Anwendung verifiziert werden, da Neutralisationseffekte der mineralischen Zahnsubstanz (Hydroxylapatit) die pH-Verteilung innerhalb der Probe beeinflußen. Fluoreszenztechniken wurden ebenfalls ergänzend eingesetzt zur Charakterisierung von kovalent modifizierten Implantatoberflächen. Die, durch Silanisierung von Titantestkörpern mit Triethoxyaminopropylsilan eingeführten freien Aminogruppen konnten qualitativ durch den Einsatz eines aminspezifischen Farbstoffes identifiziert werden. Diese Art der Funktionalisierung dient dem Zweck, Implantatoberflächen durch chemische Kopplung adhäsionsvermittelnder Proteine bzw. Peptide dem Einheilungsprozeß von Implantaten in den Knochen zugänglicher zu machen, indem knochenbildende Zellen zu verbessertem Anwachsverhalten stimuliert werden. Die Zellzahlbestimmung im Adhäsionstest wurde ebenfalls mittels Fluoreszenzfarbstoffen durchgeführt und lieferte Ergebnisse, die belegen, daß die durchgeführte Modifizierung einen günstigen Einfluß auf die Zelladhäsion besitzt.

Funktionale Bedeutung der Protein Kinase C - delta (PKC - delta) in der Reorganisation der zytoskelettären Architektur humaner Keratinozyten

Die Kontaktihibition, d.h. die Zell-Zell-Kontakt-vermittelte Proliferationskontrolle, stellt einen fundamentalen Mechanismus zur Aufrechterhaltung der Homöostase in vitro und in vivo dar. So stellen in der Zellkultur nicht-transformierte Zellen in der Regel ihr Wachstum ein, sobald sie einen einschichtigen Zellrasen gebildet haben. Umgekehrt zeichnen sich transformierte Zellen durch einen Verlust der Kontaktinhibition aus. Sie wachsen nach Erreichen eines konfluenten Zellrasens mehrschichtig weiter, und es kommt zur Ausbildung charakteristischer Foci. In dieser Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass die Proteinkinase C - delta eine wichtige Funktion in der Regulation der Zytoarchitektur humaner Keratinozyten besitzt und zugleich über Modulation der Zell-Zelladhäsion, insbesondere über Cadherin und Catenin, Einfluss nimmt.

Synthese und Konformationsanalyse von Glycopeptiden aus der homophilen Erkennungsregion des LI-Cadherins

Über die Sekundärstruktur von LI-Cadherin ist bislang wenig bekannt. Es gibt keine Röntgenanalysen und keine NMR-spektroskopische Untersuchungen. Man kann nur aufgrund der Sequenzhomologien zu den bereits untersuchten klassischen Cadherinen vermuten, daß im LI-Cadherin ähnliche Verhältnisse in der entscheidenden Wechselwirkungsdomäne vorliegen. In Analogie zum E-Cadherin wurde angenommen, daß es im LI-Cadherin eine „homophile Erkennungsregion“ gibt, die in einer typischen beta-Turn-Struktur mit anschließenden Faltblattbereichen vorliegen sollte. Um den Einfluß verschiedener Saccharid-Antigene auf die Turn-Bildung zu untersuchen, wurden im ersten Teil der vorliegenden Arbeit verschiedene Saccharid-Antigen-Bausteine synthetisiert, mit denen dann im zweiten Teil der Arbeit durch sequentielle Festphasensynthese entsprechende Glycopeptidstrukturen aus dieser Region des LI-Cadherins aufgebaut wurden. Zur Synthese sämtlicher Antigen-Bausteine ging man von D-Galactose aus, die über das Galactal und eine Azidonitratisierung in vier Stufen zum Azidobromid umgesetzt wurde. In einer Koenigs-Knorr-Glycosylierung wurde dieses dann auf die Seitenkette eines geschützten Serin-Derivats übertragen. Reduktion und Schutzgruppenmanipulationen lieferten den TN Antigen-Baustein. Ein TN-Antigen-Derivat war Ausgangspunkt für die Synthesen der weiteren Glycosyl-Serin-Bausteine. So ließ sich mittels der Helferich-Glycosylierung der T Antigen-Baustein herstellen, und der STN-Antigen-Baustein wurde durch eine Sialylierungsreaktion und weitere Schutzgruppenmanipulationen erhalten. Da die Route über das T-Antigen-Derivat den Hauptsyntheseweg für die weiteren komplexeren Antigene bildete, wurden verschiedene Schutzgruppenmuster getestet. Darauf aufbauend ließen sich durch verschiede Glycosylierungsreaktionen und Schutzgruppenmanipulationen der komplexe (2->6)-ST-Antigen-Baustein, (2->3)-Sialyl-T- und Glycophorin-Antigen-Baustein synthetisieren. Im nächsten Abschnitt der Doktorarbeit wurden die synthetisierten Saccharid-Antigen-Serin-Konjugate in Festphasen-Glycopeptidsynthesen eingesetzt. Zunächst wurde ein mit dem TN Antigen glycosyliertes Tricosapeptid hergestellt. Mittels NMR-spektroskopischen Untersuchungen und folgenden Energieminimierungsberechnungen konnte eine dreidimensionale Struktur ermittelt werden. Die Peptidsequenz des Turn-bildenden Bereichs wurde für die folgenden Synthesen gewählt. Die Abfolge der einzelnen Reaktionsschritte für die Festphasensynthesen mit den verschiedenen Saccharid-Antigen-Bausteinen war ähnlich. Insgesamt verlief die Festphasen-Glycopeptidsynthese in starker Abhängigkeit vom sterischen Anspruch der Saccharid-Bausteine. Sämtliche so synthetisierten Glycopeptide wurden NMR spektroskopisch charakterisiert und mittels NOE-Experimenten hinsichtlich ihrer Konformation untersucht. Durch diese Bestimmung der räumlichen Protonen-Protonen-Kontakte konnte mittels Rechnungen zur Energieminimierung, basierend auf MM2 Kraftfeldern, eine dreidimensionale Struktur für die Glycopeptide postuliert werden. Sämtliche synthetisierten Glycopeptide weisen eine schleifenartige Konformation auf. Der Einfluß der Saccharid-Antigene ist unterschiedlich, und läßt sich in drei Gruppen einteilen.

Synthese tumorassoziierter Glycopeptidkonjugate basierend auf den epithelialen Mucinen MUC1 und MUC4 als potentielle Antitumorvakzine

Die Immuntherapie stellt eine hoffnungsvolle Alternative zu etablierten Behandlungsmethoden für Krebserkrankungen dar. Durch die Aktivierung des Immunsystems erhofft man sich eine selektive Abtötung von Tumorzellen. Eine solche Aktivierung kann durch Vakzinierung mit Glycopeptiden, welche Partialstrukturen tumorassoziierter Oberflächenglycoproteine darstellen, erfolgen. Um eine effektive Immunantwort zu erreichen, ist allerdings eine Konjugation dieser Glycopeptide mit immunogenen Trägern nötig. Zur Darstellung solcher Konjugate wurden im Rahmen dieser Arbeit zunächst mehrere, mit tumorassoziierten Kohlenhydraten glycosylierte Aminosäurebausteine dargestellt. Diese Bausteine wurden anschließend zur Festphasensynthese von Glycopeptiden eingesetzt. Durch ein neuartiges, chemoselektives Kupplungsverfahren konnten diese tumorassoziierten Glycopeptide an ein immunogenes Trägerprotein angebunden werden. Weiterhin wurde durch Festphasenpeptidsynthese ausgehend von einem tetrafunktionellen Lysin-Baustein ein dendrimeres Glycopeptid (MAP) erzeugt. Die Darstellung von vollsynthetischen Vakzinen gelang in Form von Konjugaten bestehend aus einem universellen T-Zell-Epitop und einem tumorassoziierten Glycopeptid. Diese Synthesen wurden ausgehend von einem festphasengebundenen, orthogonal geschützten Lysin durchgeführt. Abschließend wurde die Synthese von Konjugaten bestehend aus einem tumorassoziierten Glycopeptid und dem Mitogen Pam3Cys untersucht.

Knock down von Desmoglein 2 durch induzierbare Cre-spezifische Rekombination in der Maus

Desmosomen sind hoch organisierte adhäsive interzelluläre Verbindungen, die benachbarte Zellen durch Verankerung mit den Intermediärfilamenten des Zytoskeletts miteinander verknüpfen und so Zellen und Geweben Stabilität verleihen. Die Adhäsionsmoleküle der Desmosomen sind die desmosomalen Cadherine. Diese transmembranen Glykoproteine gehen im Interzellulärraum Verbindungen mit den desmosomalen Cadherinen der Nachbarzelle ein und sind im zytoplasmatischen Bereich Anheftungspunkte für weitere an der Desmosomenbildung beteiligte Proteine. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Rolle von Desmoglein 2 (Dsg 2), einem in allen Epithelien exprimierten desmosomalen Cadherin. Da der konstitutive knock out von Dsg 2 embryonal letal ist, wurde im Rahmen dieser Doktorarbeit eine transgene Maus generiert, in der die Reduktion von Dsg 2 temporär regulierbar war (konditionaler knock down). Dazu wurde der Mechanismus der RNA Interferenz genutzt, wodurch Sequenz-spezifische, post-transkriptionelle Regulation von Genen möglich ist. Unter Verwendung eines über Cre/lox-induzierbaren Vektors wurden transgene Mäuse generiert, welche nach Induktion Dsg 2 shRNA exprimieren, die in der Zelle in siRNA umgewandelt wird und zum Abbau der Dsg 2 mRNA führt. Durch Verpaarung der generierten Dsg 2 knock down Maus mit der über Tamoxifen induzierbaren Cre Deleter knock in Mauslinie Rosa26CreERT2 konnte deutliche Reduktion der Dsg 2 Proteinmenge in Leber, Darm und Herz erreicht werden. In Immunfärbungen der Leber wurde zudem eine reduzierte Desmosomenbildung durch Expression der Dsg 2 shRNA detektiert. Die für diese Versuche generierte und getestete Rosa26CreERT2 Mauslinie ermöglichte jedoch nicht in allen Zellen eines Gewebes die komplette Aktivierung der Cre Rekombinase und damit die Expression der shRNA. Dadurch entstanden mosaikartige Wildtyp/knock down-Gewebe, in denen noch ausreichend Desmosomen gebildet wurden, um die Gewebestabilität und -struktur zu erhalten. Für eine funktionale Untersuchung von Dsg 2 in Zusammenhang mit der chronisch entzündlichen Darmerkrankung Colitis ulcerosa wurden die Dsg 2 knock down Mäuse mit Darm-spezifischen, induzierbaren Cre Deleter Mäusen (VillinCreERT2) verpaart. Nach Aktivierung der Cre Rekombinase mittels Tamoxifen wurde in bitransgenen Tieren über Gabe von Azoxymethan (AOM) und Dextransodiumsulfat (DSS) Colitis ulcerosa induziert. Diese entzündliche Erkrankung des Darms ist mit der Induktion von Darmtumoren assoziiert. Bereits nach einmaliger Induktion mit AOM/DSS wurde in der ersten endoskopischen Untersuchung eine starke Entzündung des Darmgewebes und die Ausbildung von flächig wachsenden Tumoren in den Dsg 2 knock down Tieren hervorgerufen. Es ist anzunehmen, dass durch knock down von Dsg 2, und die damit verbundene verminderte Desmosomenbildung und Zelladhäsion, Infiltration von Bakterien durch die epitheliale Barriere des Darms möglich war, und so die Entzündungsreaktion in der Darmmukosa verstärkte. In Zusammenhang mit Verlust der epithelialen Festigkeit durch verringerte Zellkontakte kam es zur Hyperproliferation der Darmmukosa, die sich in Ausbildung von flächigen Tumoren äußerte. In weiteren Experimenten müssen nun die Tumore und das entzündete Gewebe der Colitis-induzierten Mäuse mittels Immunfluoreszenz untersucht werden, um Veränderungen in der Desmosomenformation in situ detektieren zu können. Des Weiteren sind Verpaarungen der Dsg 2 knock down Maus mit anderen Cre Rekombinase exprimierenden Mauslinien möglich, um den Einfluss von Dsg 2 auch in anderen Geweben, beispielsweise im Herzen, zu untersuchen. Die hier vorgelegte Arbeit zeigt also erstmalig den ursächlichen Zusammenhang zwischen Dsg 2 und dem Auftreten von Colitis-assoziierten Tumoren in einem konditionalen RNAi-vermittelten knock down Tiermodell. Die Etablierung dieser Maus ist somit das erste konditionale Mausmodell, welches die bei vielen Krebspatienten gefundenen flachzellig wachsenden Tumore in vivo rekapituliert. Vorausschauend kann man sagen, dass mit Hilfe des im Rahmen dieser Doktorarbeit entwickelten Tiermodells wichtige Erkenntnisses über die Pathologie von Darmtumoren erbracht werden können, die unser Verständnis der Colitis-induzierten Tumorentstehung verbessern.

Mucinartige Glycopeptide als Inhibitoren selektinvermittelter Zelladhäsionsprozesse

Es wurden Glycopeptide mit einer Partialsequenz aus der N-terminalen Domäne des natürlichen Selektinliganden PSGL-1 synthetisiert, welche prinzipiell als kompetitive Inhibitoren unerwünschter selektinvermittelter Zelladhäsionsphänomene fungieren könnten. Grundsätzlich könnte es möglich sein, auf diesem Wege entsprechende chronisch entzündliche Krankheiten wie rheumatoide Arthritis zu behandeln und bestimmte akut eintretende schwere Schädigungen von gesundem Gewebe sowie die Metastasenbildung maligner Tumore zu unterdrücken. Das tatsächliche Potential der hergestellten Glycopeptide als Liganden der Selektine kann nun in biologischen Tests geprüft werden. Der gewählte Ausschnitt aus dem P-Selektin-Glycoprotein-Liganden-1 (PSGL-1) reicht von Tyr48 bis Pro59 und umfasst so sämtliche Aminosäurereste der Sequenz, die für das Auftreten einer hochaffinen Rezeptorbindung erforderlich sind. Dabei ist die Seitenkette von Thr57 mit einem O-Glycan modifiziert, welches das in natürlichen Selektinliganden häufig vorkommende Tetrasaccharid Sialyl-Lewisx bzw. ein Mimetikum desselben enthält und die für Mucine typische Form der Anbindung an das peptidische Rückgrat über eine N-Acetyl-α-D-galactosamineinheit aufweist. Zum Aufbau der komplexen Glycopeptidstrukturen wurde zunächst eine Strategie für die Synthese des an die Hydroxylaminosäure gebundenen Oligosaccharids im Gramm-Maßstab ausgearbeitet. Dabei kam der Wahl eines geeigneten Schutzgruppenmusters besondere Bedeutung zu. Das entwickelte Konzept basiert allein auf chemischen Methoden und ermöglicht die parallele Herstellung potentieller Mimetika. So wurde in dieser Arbeit L-Fucose durch D-Arabinose und N-Acetyl-D-neuraminsäure durch (S)-Cyclohexylmilchsäure ersetzt. Die erhaltenen Glycosylaminosäure-Bausteine wurden schließlich in die Glycopeptid-synthesen an der festen Phase eingebracht, welche nach vollständiger Deblockierung die gewünschten Zielverbindungen lieferten.rn